الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء High Performance Liquid Chromatography HPLC

الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء

High Performance Liquid Chromatography

HPLC

ما هو جهاز الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداءHPLC) )؟

هي عبارة عن تقنية الاستشراب لفصل مكونات مزيج ما كل على حدة، وعادة تفضل طرق الاستشراب السائلة عالية الأداء على الطرق المتبعة الأخرى في التحليل الكمي، وذلك للنوعية المثالية للحلالة أو الحلالات المراد فصلها، بحيث نحصل على فصل نوعي دقيق لمكونات المزيج المراد التعرف عليه.

 الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC)، هو شكل من أشكال الكروماتوغرافيا العمودية وغالبا ما تستخدم في الكيمياء الحيوية والكيمياء التحليلية لفصل وتحديد، وقياس المركبات في مزيج واحد، حيث تستخدم عمود يحتوي على الطور الثابت (stationary Phase)، ومضخة تحرك الطور المتنقل المراد تحليله (Mobile Phase)، وكاشف لتحديد زمن الاحتباس لكل مادة، حيث أن زمن الاحتباس يختلف من مادة لأخرى، بسبب الاختلاف في الروابط البينية بين المادة المراد تحليلها والمادة الثابتة في العمود مما يؤخر ظهور المادة على الكاشف.

 مفاهيم وتعاريف أساسية:

الطور المتحرك :(mobile phase) لفصل مكونات مزيج ما، ندخل السائل المراد فصل مكوناته في تدفق متتابع، وهذا ما يسمى بالطور المتحرك.(mobile phase)  

الطور الثابت :(stationary phase) وتترك الحلالة لتعبر خلال طبقة عمود الاستشراب الحاوي على مواد أقطارها صغيرة جداً مما يمنحها سطح تماس كبير، وهذا ما ندعوه بالطور الثابت .(stationary phase)

الماد المذابة :(solutes) طالما تعبر جزيئات الحلالة عمود الاستشراب محمولة في الطور المتحرك، فإنه يتم تآثر مستمر بين جزيئات الحلالة أو الذوائب (solutes) وبين الطور الثابت، وكذلك أيضاً مع الطور المتحرك، وينتج عن هذا توازن ديناميكي.(dynamic equilibrium)

الإمرار المتماثل(isocratic elution) : عندما تتم عملية فصل مواد المزيج مع المحافظة على التركيب الثابت لمكونات الطور المتحرك، فإننا ندعو هذه العملية بالشطف (الإمرار) المتماثل.

الشطف المتدرج :(gradient elution) هو التغير المستمر لتركيب الطور المتحرك كنسبة نوع أو أكثر من المذيبات في الطور المتحرك كتابع للزمن.

برامج تحليل بيانات :(data processors) ترسل هذه الإشارات إلى برامج تحليل بيانات data processors  والذي يرسم الخطوط البيانية plot كدالة مع الزمن.

المخطط الاستشرابي :(chromatogram) يدعى المخطط الذي يظهر هذه الإشارات بالمخطط الاستشرابي، وتدعى مناطق المكونات لكل مركب بالقمم الاستشرابية (chromatographic peaks) ، وتتميز هذه القمم بالمعايير(الثوابت) parameters التالية:

العرض، المساحة، ارتفاع القمة، ومدى التذييلtailing ، وزمن العبور (الاحتفاظ) retention time ، ويدعى الجهاز الذي يقوم بهذا العمل جهاز مخطط الاستشراب.

المضخة عالية الضغط :(pump) بما أن أبعاد الأجزاء صغيرة جداً (حوالي 10 ميكرون أو أقل)، والعمود مملوء بشكل كامل فإنه لا بد من دفع حركة الطور المتحرك باستخدام مضخات عالية الضغط، وإن الجزيئات الذائبة فقط هي التي تنتقل عبر الطور المتحرك، والجزيئات التي تتفاعل مع سطح العمود سيحدث لها عرقلة بالخروج.

مميزات ال(HPLC)؟

الكروماتوغرافيا السائلة هي الآن واحدة من أقوى الأدوات في الكيمياء التحليلية، لديها القدرة على فصل وتحديد المركبات التي تكون موجودة في أي عينة يمكن حلها في السائل، والمركبات ذات التركيزات المنخفضة جداً أي آثار (أجزاء في التريليون) [PPT] فقط تكفي للكشف بسهولة عن هويته بالHPLC ، وقد تم تطبيقها مؤخراً على الأدوية والمواد الغذائية والمغذيات ومستحضرات التجميل وعينات الطب الشرعي والمواد الكيميائية الصناعية.

-1 الانحلال العالي لمواد عديدة ومتنوعة وانفصال مكوناتها في محيط واسع، وخلال زمن قصير يتراوح من دقيقة إلى ساعة، مما يؤدي إلى سهولة ودقة إنجاز العمل.

-2 إمكانية فصل الأجسام صعبة التطاير (يصعب فصلها في الكروماتوغرافيا الغازية)، وكذلك بالنسبة للمركبات غير الثابتة حرارياً (تتحول إلى مشتقاتها صعبة التطاير عند تعرضها لدرجات حرارية عالية).

-3 فصل مزائج معقدة وتحديد أو قياس آثار قليلة جداً من التراكيز (نانوغرام).

أساسيات جهاز الPrinciples of HPLC :

          يقوم جهاز HPLC بفصل مكونات العينة ثم التعرف عليها وتقديرها كمياً، ويتم الفصل عن طريق توزيع العينة ما بين طورين أحدهما متحرك والآخر ثابت.

 الأجزاء الرئيسية للجهاز:

-1 خزان المذيب -2- أنظمة الضخ -3- غرفة الحقن -4- الأعمدة -5- الكواشف -6- المسجل واختزال النتائج والشاشة.

 

   

نظام ال [HPLC]

-1 خزان المذيب Solvent Reservoir:

يقوم بإمداد الجهاز بالكمية اللازمة من المذيب (الطور المتحرك)، حيث تصنع هذه الخزانات من مادة الزجاج أو من الحديد الغير قابل للصدأ Stan less Steel وفي الغالب تتراوح عدد الخزانات من 5-1 خزانات، ومتوسط السعة للخزانات 500 ml وبعضها يصل سعته إلى لتر، وتكون هذه الخزانات في العادة مزودة ببعض الوسائل التي تساعد على التخلص من الغازات الذائبة في المحاليل تظهر على شكل فقاعات هوائية، وهذه تسبب في ظهور إشارات تحليلية غير مرغوب فيها، مما قد يسبب خلطاً في النتائج المتحصل عليها، ومن أكثر هذه الغازات : (O2 , N2)، ويتم التخلص من هذه الغازات بعدة طرق، منها:

1. باستخدام نظام التفريغ بواسطة مضخات.

2. باستخدام عملية التقطير Distillation.

3. باستخدام أجهزة تسخين وتحريك المذيبات.

4. بإمرار تيار من غاز خامل منخفض الذوبان.

5. وأحياناً هذه الخزانات تكون مزودة بمرشحات (Filters)، وذلك للتخلص من أي مواد عالقة أو غبار بالمحاليل ومنعها من الوصول إلى عمود الفصل.

-2 أنظمة الضخPumping Systems : 

يتم ضخ الطور المتحرك السائل داخل عمود الفصل على شكل ضخ ثابت، ويتم التحكم بمعدل انسياب المذيب من الخزان إلى المضخة عن طريق صمام منظم، وهناك مجموعة من المضخات الشائعة الاستخدام والتي يجب أن تتوفر فيها بعض الشروط:

1. أن تكون المضخة قادرة على إعطاء ضغط يصل إلى 400 بار، على افتراض أن العمود مصنوع من الحديد، أما في حالة الزجاج فينبغي أن يكون أقل من ذلك.

2. أن تكون المضخة خالية من الذبذبات أثناء دفعها للسوائل Pulse Free.

3. أن تكون المضخة لها سرعة سريان تتراوح بين 10-0.1 min\ml  (أي يكون لها مدى واسع).

4. أن تكون لسرعة السريان تكرارية عالية، ونسبة الخطأ لا تزيد عن % 0.56.

5. أن تحتوي على مكونات مقاومة للتآكل، خاصة ما يسمى بالمسدات Seals، وأن تكون مصنوعة من الحديد أو من التفلون.

-3 غرفة الحقن Injection Port:

هي مكان إدخال العينة المحضرة للتحليل، ويتم الحقن باستخدام إبرة حاقنة ميكرو ليترية عالية الضغط، قد تصل إلى 1500 وسعتها 2000-1 ميكرو ليتر، وعادة تستخدم 20 ميكرو ليتر.

-4 الأعمدةColumns :

مكان الفصل أو الإزاحة لمكونات المزيج، وتكون مصنوعة إما من الستانليس ستيل أو الكروم أو النيكل، أو من زجاج متحمل للضغوط العالية، والأعمدة الشائع استخدامها في جهاز الHPLC يتراوح طولها 30-10 سم، والقطر الداخلي يتراوح بين 10-4 مم، وقطر الحبيبات الشائع استخدامها يتراوح بين 10-5 ميكرومتر، وعادة يكون العمود بطول 25 سم وقطره 4 مم، وقطر الجزيئات 5 ميكرومتر، وفي أجهزة الHPLC الحديثة تستخدم أعمدة ذات أبعاد أصغر، حيث يتراوح طول العمود بين5-0.2  سم وقطره 4.6-1 مم، وقطر الحبيبات 5-3 ميكرومتر، وتعتمد كفاءة الفصل على مواصفات العمود، وبصفة خاصة على قطر المادة المعبأة، وبغض النظر إذا كانت المادة المعبأة ذات حجوم واحدة، فإنه يتطلب ضغط عالي نسبياً لتعطي معدل السريان المطلوب وهو 2-1 سم/ دقيقة، فإذا كان عمود أبعاده 25 سم × 4 مم، ومعبأة بجزيئات قطرها 15 ميكرومتر، فإنه يتطلب حوالي 30 ضغط جوي للحصول على معدل سريان 1 سم/ دقيقة من الهيكسان وإلى ضغط جوي قدره 50 على معدل سريان مناسب للمذيبات والأكثر لزوجة مثل الماء.

          وللحصول على معدل السريان المناسب، لا بد أن تكون حجم الحبيبات صغيرة يتراوح قطرها بين 10-3 ميكرومتر، وهذا هو الشائع في أجهزة التحليل الكروماتوغرافي الحديثة، كذلك لا بد من وجود ضغط عالي يصل إلى 100 ضغط جوي، لذلك يعتبر HPLC أفضل طرق التحليل الكروماتوغرافي.

-5 الكواشفDetector :

          يقوم الكاشف برصد مكونات العينة لحظة خروجها من عمود الفصل، ويحدد كمية أو تركيز المكون استناداً إلى قياس التغيرات التي تصيب إحدى خواص الطور المتحرك نتيجة احتوائه على هذا المكون أو ذاك، ويبعث إشارات كهربائية إلى مضخم الإشارة حيث يتم تكبيرها ثم نقلها إلى المصحح (اختزال النتائج) ومن ثم المسجل ليتم تسجيلها على شريط المسجل الكروماتوغرامي.

          يراعى عند اختيار الكاشف المناسب:

·        درجة التذبذب

·        درجة الحساسية

·        التخصص

·        زمن الاستجابة

أهم الكواشف:

·        كاشف UV/VIS طول الموجة من 800-254 نانومتر.

·        كواشف متخصصة ذات حساسية عالية:

    الاسبكترو فوتومتري وهو يقسم إلى ذو موجات طولية متغيرة 600-190 نانومتر وذو موجات طولية ثابتة.

    الفلورسينس 600-190 نانومتر لها لمبة خاصة.

·        أقل حساسية:

    كاشف معامل الانكسار.

    كاشف التأين باللهب.

    كاشف الناقلية الكهربائية.

تقوم المركبات العضوية بامتصاص الاشعاعات ذات أطوال موجات ضمن مجال طيف UV والاختلاف في الامتصاصية حسب طبيعة كل مكون يقابله تغير في الإشارة الكهربائية المرسلة إلى المسجل.

-6 المسجل واختزال النتائج والشاشة PC,Processing,Display:

·        المسجل: هو جهاز يقوم باستقبال الإشارات الكهربائية المرسلة من جهاز قياس فرق الجهد وترجمتها إلى كروماتوغرامات.

·        اختزال النتائج: عبارة عن شريحة الكترونية لمعالجة المعلومات وطباعتها بشكل رقمي على الشاشة.

مميزات المسجل المثالي: 

1. أن يكون ذو حساسية ملائمة للقياس المطلوب.

2. أن يكون ذو ثباتية جيدة Reproducibility وتكرارية عالية.

3. أن يكون له زمن استجابة قصيرة، ومستقلة عن سرعة السريان.

4. أن يمكن الاعتماد على النتائج المتحصل عليها، وأن يكون سهل الاستخدام من قبل أشخاص غير مؤهلين بخبرة كافية.

5. أن يكون ذو استجابة عامة لمعظم العينات المقاسة، أو أن يكون له استجابة انتقائية لمجموعة معينة من المواد.

من تطبيقات HPLC في الأغذية:

          تقدير الأحماض الأمينية – تقدير الببتيدات – تقدير بروتينات الغذاء – تقدير الليبيدات – تقدير الفوسفوليبيدات – تقدير الكربوهيدرات – تقدير الفيتامينات الذوابة في الدهون – تقدير الفيتامينات الذوابة في الماء – تقدير الأحماض العضوية – تقدير الكاربامات واليوريا في الأغذية – تقدير المركبات الفينولية – تقدير القواعد العضوية وغيرها.

تقدير البروتينات في الغذاء:

          تركز الأبحاث الجارية على بروتينات الغذاء بشكل رئيسي على القيمة الحيوية والقيمة الغذائية للبروتين، بالإضافة إلى خصائصها الوظيفية والحسية، وكانت بروتينات الحليب هي الأكثر دراسة، ومن ثم بروتينات الحبوب والبيض واللحوم والخضراوات والمشروبات المختلفة.

طريقة التقدير:

إعداد العينة: تعتبر الخطوة الحاسمة التي تؤثر على نتائج تحليل البروتين بأكمله، وتختلف طرق الاستخلاص حسب نوع البروتين، حيث يتم تحطيم الأنسجة من خلال وضعها في آلة طحن للحصول على عين متجانسة، أما في العينات الغنية بالدهون فنقوم باستخدام المذيبات العضوية (كالأسيتون أوالايتر) قبل استخلاص البروتين.

          الفصل: يعتبر العمود هو الجزء الأكثر أهميةً في تأثيره على عملية الفصل، من حيث انتقائية العمود وأدائه (طول العمود وقطره الداخلي وقطر الحبيبات المستخدمة).

          الكشف: يتم باستخدام الأشعة فوق البنفسجية على نطاق واسع، وذلك عند أطوال موجية 280 نانومتر أو (220-200) نانومتر.

          فمثلا في الألبان تم تقدير وتوصيف بروتينات حليب الأبقار والأغنام والماعز والجاموس بالإضافة لبروتينات حليب الرضاعة وبروتينات مصل الحليب والجبن وكريمة الشوكولا.

          أما في البيض، فلقد تم تقدير بروتينات بياض البيض (بيض الدجاج)، وتم تحديد أربعة أنواع من البروتينات الموجودة بوفرة وهي: lysozyme ,ovotransferrin, ovoalbumin flavoprotein,

واثنتان بكمية منخفضة وهما: ovomucoid ovoglycoprotein,، وتم تقدير البروتينات لأول مرة في قشور البيض باستخدام تقنية الHPLC.

          في الحبوب، تم تقدير وتوصيف بروتين القمح وبروتينات الذرة والشعير والجاودار.

          في الخضراوات، تم تقدير البروتينات في فول الصويا (الغلوبيولين)، بالإضافة إلى تحديد بروتينات مضادة للسرطان في فول الصويا، وتقدير البروتينات في الزيتون.

          في المشروبات، تم تقدير البروتينات في النبيذ (حيث تلعب دوراً هاماً في نوعية المشروبات)، فتم تحديد 20 نوع من البروتينات (سواءً من العنب-الخميرة-البكتيريا-الفطريات)، كما تم تقدير البروتينات في عصير التفاح وفي شراب الشعير وغيرها.

من فوائد استخدام جهاز ال :HPLC

1.     كشف الغش (مثلاً استبدال الحليب البقري مع غيره في صناعة الألبان، في كشف غش العسل).

2.     تحديد منشأ ومصدر الحليب أو الجبن، هل هو بقري أو غنم أو ماعز أو غير ذلك.

3.     تمييز وتوصيف سلالات القطيع، كما في تمييز الأبقار السويدية عن الدانماركية من خلال تقدير تركيز α لاكتو ألبومين الموجود في حليبها.

4.     تم تحديد البروتينات والمواد المسببة للحساسية الغذائية بتقنية ال HPLC، كبروتينات الحليب والبيض وفول الصويا المسببة للحساسية للإنسان عند تناولها.

5.     تحديد جودة الخبز، من خلال دراسة التغيرات الحاصلة لبروتينات الغلوتين، ومن خلال دراسة نسبة الاستخلاص.

6.     تحديد صلاحية الأسماك وجودتها أثناء إنتاجها وتخزينها، كسمك السلمون المرقط، وذلك من خلال دراسة التغيرات الحاصلة في بروتينات أنسجة الأسماك.

                                                                       Eng. Mahmoud Sheikh Muhammad